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免疫組化的操作步驟

2024-03-22 [657]

一 免疫組化( LP 法)操作步驟 :


1. 切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復,可在此步后進行


2. 緩沖液洗 3min/2 次。


3. 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。


4. 緩沖液洗 5min/2 次。


5. 滴加 Ultra V Block , 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。


(注:孵育不要超過 10 分鐘,否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 - 10% 正常羊血清,這一步可以省略。)


6. 緩沖液洗 5min/2 次。


7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小時。(具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定)


8. 緩沖液洗 5min/2 次。


9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鐘。


10 .緩沖液洗 5min/2 次。


11 .滴加 HRP Polymer( 酶標二抗 ) ,在室溫下孵育 30 分鐘。


(注: HRP Polymer 對光敏感,應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。)


12 .緩沖液洗 5min/2 次。


13 .向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen ) , 混勻后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分鐘。(具體時間由染色深淺決定。)


14 .自來水充分沖洗 , 復染,脫水 , 透明 , 封片。

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二.免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟 :


( 1 )、石蠟切片脫蠟至水。


( 2 )、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。


( 3 )、蒸餾水沖洗, PBS 浸泡 5 分鐘 x2 (如需抗原修復,可在此步后進行)。


( 4 )、 5-10% 正常山羊血清( PBS 稀釋)封閉,室溫孵育 10 分鐘,傾去血清,勿洗。滴加 一抗 工作液, 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。


( 5 )、 PBS 沖洗, 5 分鐘 x3 次。


( 6 )、滴加適量 生wu素標記二抗 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。


( 7 )、 PBS 沖洗, 5 分鐘 x3 次。


( 8 )、滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。


( 9 )、 PBS 沖洗, 5 分鐘 x3 次。


( 10 )、顯色劑顯色 3-15 分鐘( DAB 或 NBT/BCIP )


( 11 )、自來水充分沖洗,復染,脫水,透明,封片。



三. 冰凍切片免疫組化染色步驟:


冰凍切片 4-8um ,室溫放置 30 分鐘后,入 4 ℃丙酮固定 10分鐘,PBS洗,5分鐘x3,用過氧化氫孵育5-10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。以下同石蠟切片免疫組化


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